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成果推介丨No.8 Salecan®对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用

发表时间:2023-01-04 10:06

成果推介丨No.8

Salecan®对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用

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01 研究背景

四氯化碳 (CCL4) 是一种众所周知的肝毒素,在一系列实验动物中用作实验性肝损伤的化学诱导剂[1] 。CCL4最初在肝脏中被细胞色素 P450 i 相系统生物激活,因此,该毒物转化为反应性代谢三氯甲基自由基 (CCL4) 和替代三氯甲基自由基抗氧化基因与毒物诱导的肝损伤减少相关[2]。如果 CCL4未达到致死剂量,动物可从该毒物引起的肝损伤中恢复。尽管近几十年来,对肝损伤发病机制的理解取得了进展,但在肝病治疗干预方面几乎没有突破。因此,通过研究确定Salecan®对肝病的治疗是重中之重,也是迫切需要。


02 成果关键词

Salecan®;CCL4;肝急性损伤;氧化应激;肝细胞增殖


03 摘 要

四氯化碳 (CCL4) 是用于筛选保肝药物的成熟模型。本研究的目的是评价一种新型可溶性β葡聚糖Salecan®对CCL4诱导的小鼠急性肝损伤的潜在保护作用,并进一步探索其潜在机制。在单次腹膜内给予CCL4前,给予小鼠Salecan®或磷酸盐缓冲盐水3天。在注射CCL4后0、12、24、48、72和 96 h 处死动物。随后评价了血清肝酶水平、组织学、脂质过氧化、谷胱甘肽 (GSH) 含量、抗氧化酶的表达和肝细胞增殖。与对照组相比,Salecan®预处理组血清肝酶标志物水平显著降低。肝脏组织病理学检查显示,CCL4中毒早期肝细胞变性和坏死显著减弱,Salecan®预给药小鼠后期肝脏恢复显著加速。此外,Salecan®给药显著减轻脂质过氧化,恢复 GSH 耗竭。同时,Salecan®给药组的抗氧化基因表达显著升高。在注射CCL4后的恢复期,Salecan®给药显著增强了肝细胞增殖。综上所述,这些结果表明,Salecan®通过减轻氧化应激和加速肝细胞再生,对CCL4诱导的急性肝损伤表现出保护作用。


04 研究成果简介

Salecan®,由新型菌株农杆菌ZX09发酵产生,是一种新型水溶性细胞外β葡聚糖。与其他β葡聚糖一样,Salecan®也可能具有包括抗氧化在内的生物活性,既往研究表明,氧化应激是毒物早期诱导肝毒性的主要发病机制[3] 。在后期,肝细胞增殖是毒物诱导肝损伤期间肝脏恢复的重要因素 [4]。几项证据表明,一些β葡聚糖可增强细胞增殖。基于上述观察结果,本研究在小鼠模型中评价了Salecan®在CCL4引起的急性肝损伤的修复作用。


05 实验结果

本研究使用动物为8周龄 C57BL/6 小鼠。动物以12:12 h光照-黑暗周期饲养,上午7:00开灯,下午7:00关灯,自由进食和饮水。对于急性肝损伤实验,将动物随机分为4组(n= 每组5只):

(1) 空白组组接受磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 和橄榄油;

(2) 对照组接受Salecan®(溶于PBS)和橄榄油;

(3) CCL4(溶于橄榄油)+ PBS处理组;

(4) CCL4 + Salecan®组。Salecan在 CCL4 给药前3天,每日一次给予注射剂量或溶媒。末次 Salecan®给药后2小时,小鼠接受1 ml/ kg的CCL4 。在注射 CCL4   后0、12、24、48、72和 96 h 处死动物。采集血样用于生化参数测定,分离肝组织并立即用于制备mRNA,然后在液氮中冷冻用于后续分析,但左叶部分用于组织学分析。


06 结果与分析

- Salecan®保护肝脏免受 CCL4 诱导的急性损伤‍ -

初步测定了血清ALT、AST和 LDH 活性,以评价Salecan®对 CCL4 诱导的急性肝损伤的影响在小鼠中。值得注意的是,在注射CCL4后24和48 h,与CCL4 + PBS组相比,Salecan® + CCL4给药小鼠的血清ALT、AST和 LDH 活性显著且显著降低。由图1 可知,CCL4给药后12小时,PBS组肝脏出现更多空泡化和明显的脂肪变性,而Salecan®给药组无明显脂肪变性,空泡化肝细胞数量也减少。在注射CCL4 后24 h,在 PBS 组中观察到小叶中心坏死。然而,相同时间点Salecan®预处理组的肝脏显示脂肪变性而非坏死。48 h时,两组肝脏均出现广泛的小叶中心坏死,其中在 CCL4前给予Salecan®导致坏死面积较 PBS 组减少。值得注意的是,72 h时,PBS组的坏死过程持续存在;然而,Salecan®给药小鼠的肝脏切片显示坏死面积小得多,表明Salecan®可在 CCL4 诱导的肝毒性期间加速肝脏恢复。在96 h,两组的肝脏组织学恢复到接近正常水平。

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图1

图1,Salecan®预处理对各组组织学变化的影响。显示了磷酸盐缓冲盐水组 (A、C、E、G、I、K) 和 Salecan 预处理组 (B、D、F、H、J、L) 肝组织切片的苏木精和伊红染色的代表性照片。(C,插图)白色和黑色箭头分别表示脂肪变性和空泡形成;(D,插图)黑色箭头表示空泡形成;(E,插图)黑色箭头表示小叶中心坏死;(F,插图)白色箭头表示脂肪变性。


- Salecan®对CCL4处理后肝脏MDA和GSH含量的影响‍ -

我们测定了肝脏丙二醛 (MDA) 和 GSH 含量,以评价Salecan®对 CCL4诱导的氧化应激的影响。如图2(A),在CCL4 + PBS组中,与对照组相比,CCL4给药后 MDA 的生成显著增加;然而,用Salecan®预处理可消除CCL4诱导的肝脏脂质过氧化作用。此外,CCL4处理后,细胞内主要抗氧化剂 GSH 的含量显著降低,但用Salecan®预处理的小鼠显示 GSH 含量显著增加(图2 B)。

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图2

图2,在注射 CCL4 后24 h,Salecan®给药前降低了肝脏脂质过氧化作用并恢复了 GSH 消耗。通过测定 (A) 肝脏 MDA 含量和 (B) 肝脏 GSH 含量测定脂质过氧化作用。所有值均为平均值±SEM(n = 4-5)。与PBS + CCL4 组相比,*P < 0.05,**P < 0.01。


- Salecan®对肝脏抗氧化基因表达的影响 -

在我们接下来的一系列研究中,我们进一步分析了Salecan®对肝脏抗氧化基因表达的影响,以更好地理解Salecan®与肝脏抗氧化系统关联的潜在机制。如图3所示。在本研究中,Salecan®通过减弱脂质过氧化作用减少 CCL4介导的氧化应激,表现出保护作用,表现为 MDA 水平降低。此外,Salecan®可恢复 CCL4 处理后的肝脏 GSH 消耗。最后,我们进行了 PCNA 免疫染色,以确定Salecan®单次给予 CCL4 后是否能增加小鼠肝脏的肝再生。图3显示了注射 CCL4 后48、72和96 h PBS +CCL4 处理小鼠和Salecan®+CCL4 处理小鼠肝脏的 PCNA 免疫染色结果。在所有时间点,与 PBS 组相比,Salecan®给药组的 PCNA 阳性肝细胞均急剧增加。因此,抗氧化特性可能是Salecan®保护 CCL4 介导的肝损伤的机制之一。

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图3

图3,CCL4给药后12 h,Salecan®上调肝脏抗氧化基因表达。(A) 各抗氧化基因表达的代表性 PCR 结果;进行定量实时 PCR 分析,以显示各组中Nrf‐2(B)、Mn‐SOD(C)、Cu、Zn‐SOD(D)、CATase(E)、HO‐1(F) 和γGCS(g) 的表达。所有值均为平均值±SEM(n = 4-5)。与PBS + CCL4 组相比,*P < 0.05。


06 结 论

在本研究中发现,Salecan®可有效减弱CCL4诱导的小鼠肝损伤,原因在于:(1)Salecan®预处理可显著降低 CCL4 注射诱导的血清肝酶活性(ALT、AST和LDH)升高;(2)Salecan®处理可使肝细胞变性和坏死显著减少,肝脏恢复显著加速。这种保护作用的机制与Salecan®可显著减轻 CCL4 中毒期间的氧化应激并加速肝细胞再生有关。因此,作为一种新型β-葡聚糖,Salecan®在刺激细胞增殖方面具有潜在功能。在这项工作中,与对照动物相比,在Salecan®给药小鼠后期(48、72和96 h)检测到 PCNA 阳性细胞增加。结果提示,Salecan®可通过刺激增殖加速肝细胞恢复,减轻肝损伤。



*本篇文章节选了部分实验数据,欢迎大家交流学习。


参考文献

[1] Correspondence to: Jianfa Zhang, Center for Molecular Metabolism, Nanjing.


[2] Correspondence to: Jianfa Zhang, Center for Molecular Metabolism, NanjingUniversity of Science and Technology, Nanjing, 210094, China.


[3]Nanjing Jinling Hospital, Nanjing, 210002, China.


[4] School of Chemical Engineering, Nanjing University of Science and Technology,Nanjing, 210094, China.



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